第四章 酶促反应动力学（影响反应速率的因素）

酶促反应动力学主要研究反应速度变化规律，以及酶浓度、底物浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂等条件对反应速率的影响；研究单一因素时，其余条件保持恒定，仅测定反应初速度，可推导酶作用机理、确定最佳工艺条件。

4.1 酶浓度、底物浓度对反应速度的影响

1. 酶浓度的影响

温度、pH固定，底物充足过量时，反应速度与酶浓度成正比，公式：v=K[E]。底物完全饱和后，酶分子数量越多，单位时间催化生成产物越多。

2. 底物浓度的影响

酶浓度不变，底物浓度与反应速度呈矩形双曲线关系：

①底物极低：速度随底物浓度线性上升；

②中等浓度：增速放缓；

③底物饱和：速度达到Vmax，继续增加底物，反应速度不再提升。

4.2 米氏方程、Km与Vmax意义、双倒数作图测定

1. 米-曼氏方程式

v = Vmax[S] / (Km + [S])

E+S⇌ES→E+P，ES复合物为中间过渡物，初速度下逆反应可忽略。

2. Km、Vmax核心含义

（1）Km：反应速度等于1/2 Vmax时对应的底物浓度，单位mol/L；Km越小，酶和底物亲和力越强，低底物浓度即可达到高反应速度。

（2）Km是酶特征常数，仅与酶、底物、温度、pH有关，和酶浓度无关；同一酶对应不同底物Km值不同。

（3）Vmax：底物完全饱和时最大反应速度，与酶总浓度成正比；可计算转换数Kcat（单位活性中心每秒转化底物分子数）。

3. 双倒数作图法（Lineweaver-Burk）

将米氏方程变形取倒数：1/v = Km/Vmax · 1/[S] + 1/Vmax

以1/v为纵轴、1/[S]为横轴作图得到直线：

斜率=Km/Vmax；纵轴截距=1/Vmax；横轴截距=-1/Km；可精准算出Km与Vmax。

4.3 温度、pH对酶活力的影响规律

1. 温度影响与最适温度

低温区间：升温加快分子运动，反应速度上升；

超过最适温度：高温使蛋白质变性失活，速度快速下降，整体曲线呈钟罩形。

最适温度不是固定常数，和反应时长相关：短时反应测得最适温度偏高，长时间反应偏低。

2. pH影响与最适pH

pH改变会改变酶活性中心基团、底物、辅酶的电离状态，影响ES复合物结合，速度曲线多为钟罩型。

动物酶最适pH多6.5~8.0，胃蛋白酶1.5~2.5；植物、微生物酶多4.5~6.5；缓冲体系、底物浓度会小幅改变最适pH。强酸强碱直接造成酶不可逆变性。

4.4 激活剂的分类与激活作用

激活剂是可提升酶催化活性的物质，分为三类：

1.无机离子：金属阳离子、阴离子，稳定酶构象或充当活性中心组成部分；

2.小分子有机化合物；

3.生物大分子激活物。

激活剂存在浓度阈值，过高浓度反而会抑制酶活性。

4.5 抑制剂与酶抑制类型

抑制剂可降低酶活性，区分两类：强酸强碱造成蛋白变性属于钝化，不属于抑制；抑制作用仅改变活性中心基团，酶蛋白骨架不变。分为不可逆抑制、可逆抑制。

4.5.1 不可逆抑制（重金属、有机磷农药中毒机理）

抑制剂与酶必需基团形成稳定共价键，透析、超滤无法解除抑制，永久降低酶活力。

1.非专一性不可逆抑制：重金属Pb²⁺、Hg²⁺、砷剂结合巯基；可用二巯基丙醇解毒置换金属离子；

2.专一性不可逆抑制：有机磷（敌敌畏、DIFP）共价结合胆碱酯酶丝氨酸羟基，乙酰胆碱堆积引发抽搐中毒；解磷定可置换磷酰基恢复酶活；氰化物、CO结合金属辅基酶。

4.5.2 可逆抑制：竞争性、非竞争性、反竞争性抑制对比

抑制剂以非共价键松散结合，透析可恢复酶活性，分为三类：

1.竞争性抑制：抑制剂结构类似底物，竞争结合活性中心；增大底物浓度可完全解除抑制；Km变大，Vmax不变；例：丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶、磺胺药抑菌。

2.非竞争性抑制：抑制剂结合酶非活性中心区域，ES、E均可结合抑制剂生成无活性EIS；增加底物无法消除抑制；Km不变，Vmax下降。

3.反竞争性抑制：仅能与ES复合物结合生成EIS；Km、Vmax同步等比例降低，双倒数图为平行直线。